簡略質量研究案例（四）

在整個質量標準的各項檢查中，有關物質項占據了大半“江山”，同時，在整個質量研究的分析方法研究過程當中，有關物質項也占據了很大的一部分精力。在快的時間內設計或者選擇一個“穩健”的有關物質方法，成為項目完成與否的關鍵。

對于暫未有藥典收載的藥物，通常會從整個雜質譜的結構分析開始。對于結構的分析，又要往前翻到本系列的篇簡略質量研究案例（一）點擊藍字回看，根據文中所述，去各網站或者數據庫中查詢并歸納各個雜質的性質，根據性質來選擇波長、色譜柱、流動相等。對于波長的選擇，在有關物質方法的檢查中，與含量中波長的選擇依據有差異。對于含量分析方法來說，更關心的是主成分的吸收，而對于有關物質分析來說，更關心的是各個雜質的穩定檢出。雜質限度較低，波長選擇的差異容易影響到各個雜質的限度。而流動相和固定相（色譜柱）等色譜條件的選擇，則會影響到方法的穩健性。一個穩健的分析方法，會讓我們的分析方法驗證、分析方法轉移等工作更加順暢。一個耐用性較差的方法，不止會在整個研究過程當中虐得我們si去活來，還會影響研究數據的準確性。

當然，對于我們今天所需要討論的氟哌啶醇有關物質檢查項來說，因為已有各國藥典收載，故一般還是從藥典方法開始進行篩選。

目前，中國藥典、美國藥典、歐洲藥典、英國藥典及日本藥典均收載了其有關物質檢查分析方法，各藥典對比如下：

對比四國藥典，均采用C18的色譜柱，EP還特別標注了堿去活封尾色譜柱。從本系列的節開始，我們就知道，氟哌啶醇是一個弱堿。在我們接觸液相色譜開始，相信絕大多數人都知道，硅膠基質的色譜柱，容易封尾不*而存在一些弱酸性的硅羥基活性位點（Si-OH），這些活性位點會增強對離子化后的堿性化合物的保留而造成拖尾。當然，堿性化合物的拖尾不止這一點，還包括過載引起的拖尾。對于液相色譜拖尾問題，小編在本公眾號之前的一個系列中有詳細闡述。（奉送直達車：峰型那些事（一））。除中國藥典未標注色譜柱規格外，其他三國藥典所用的色譜柱從規格上看，柱效基本一致。流動相體系的選擇，則是分離策略的選擇。

ChP2015所用的磷酸鹽緩沖體系，pH剛好在其緩沖范圍外，但是，其磷酸鹽濃度較常規使用的高（50mmol/L），應該能彌補這一點，另外，ChP2015的供試品濃度并不高（1mg/ml），也彌補了流動相緩沖能力不夠的缺點。但從主成分氟哌啶醇來說，再降低一些流動相pH，比如用pH=3.0，可能更加合適。當然，我們一直所說的，單一個組分無所謂方法，對于有關物質來說，更多的考慮是其他組分，而不單單是主成分。對于氟哌啶醇這個項目，小編純屬紙上談兵，并未深入，而實際當中具體的選擇，還是根據具體的工藝來實現。

對于JP17，其選擇的緩沖鹽體系剛好在檸檬酸鹽的緩沖范圍內（pKa1=2.1~4.1），但是，其選擇的波長（220nm）又超出了檸檬酸鹽的截止波長（230nm），超出了截止波長就意味著本底有吸收，可能會影響定量限的濃度水平。另外，JP17還加入了一個小編很不喜歡的離子對-十二烷基硫酸鈉（SDS）。SDS作為陽離子對試劑，一方面可以增加氟哌啶醇的保留，另一方面，則可以改善峰型。但是SDS的使用存在一些缺陷，市售的SDS質量差異非常大，換個品牌或者換個批次，會發生無法重現方法的問題。這是因為市售SDS純度差異較大的以及組成差異的關系。以SDS為離子對試劑帶來的另一方面的困擾是方法耐用性較差，使用的過程當中，必須量取流動相的各組分，確保每次配制的流動相比例一致。否則，微小的緩沖鹽-有機相比例差異可能會造成較大的保留時間差異。

USP40\EP9.0\BP2019方法一致，均為緩沖液-乙腈體系。在常規的使用中，四丁基硫酸氫銨在大多數場合均作為離子對試劑出現。但在USP40\EP9.0\BP2019方法中，其并不是作為離子對存在。折算下濃度，其在流動相中的濃度也不低（50mmol/L），一方面，作為增加離子強度的緩沖鹽，該濃度下溶液的pH應為2~3。另一方面，更重要的，是作為與待測組分相同的離子組分存在于流動相中，形成離子氛，減少氟哌啶醇與固定相間的相互作用，減少拖尾。四丁基硫酸氫銨作為一個陽離子，也能與固定相中的活性硅羥基作用，同樣能從另一方面減少拖尾。由此可見USP40\EP9.0\BP2019在多方面改善了有關物質的峰形問題，過載問題（峰形問題），當然，過載后的峰形較差，峰寬較寬，會影響主峰附近的雜質峰分離，進而影響各雜質的定量限濃度。由于有了上述的一些措施，USP40\EP9.0\BP2019的供試品濃度能使用較高的濃度（10mg/ml），較高的供試品濃度意味著更低的檢出限。

稀釋劑的選擇，氟哌啶醇在分子狀態其疏水性并不低，故USP40\EP9.0\BP2019選擇了純甲醇來作為稀釋劑。而ChP2015和JP17的流動相均為酸性緩沖液和高比例的有機相，且其供試品濃度較低，用流動相作為稀釋劑既方便又可以滿足稀釋的能力。

相較于ChP2015和JP17的等度，USP40\EP9.0\BP2019的梯度方法現階段更易被接受。一般認為梯度方法能有更高的區分力和區分范圍，較等度方法更科學合理。

至于波長及流速的選擇，不同的流動相體系也會影響UV曲線的表現以及組分的保留情況，至于如何選擇，跟所需分離的有關物質有關。綜合考慮，選擇you的組合。

至于供試品濃度及進樣量，前述段落中已有所表述。

至于計算方式是選擇外標法還是主成分自身對照法，亦或是主成分外標法，還是主成分外標/自身稀釋對照外標加校正因子法，取決于產品的特性，從成本角度，方便角度，科學合理角度綜合考慮，選擇即合理又方便的方式。

限度的考察，條即來自于ICH的限度要求。根據每日大劑量，推算產品的單雜限度。對于藥典中已列明的已知雜質，可參照藥典標準進行修訂。終定入質量標準的雜質并不是越多越好。越多的雜質表明后續測試愈加繁瑣，而我們的目標，是在盡量少的操作中，控制風險，使得產品更加安全可靠。

有沒有小伙伴要問小編：難道USP40\EP9.0\BP2019就*了嗎？USP40\EP9.0\BP2019所使用的四丁基硫酸氫銨會吸附在色譜柱上，可能會使該色譜柱改性而不便于其他產品的使用。另外，四丁基硫酸氫銨的使用，可能會減少色譜柱的壽命。對的，成本的增加也是方法的缺陷哦！~我記得在前述的某篇文章中曾提到，沒有的方法，只有適合的方法。

ChP2015及JP17，在限度以及各方面均能滿足的情況下，也算一個合適的方法。至于如何挑選，一定是綜合各方面的情況后綜合選擇的。至于方法是否在各方面均能滿足，需要通過分析方法學驗證來確證。分析方法學驗證如何做，且聽下回分解！~