案例分享，手把手教你液相色譜梯度優(yōu)化

各位小伙伴在實驗分析中應該都遇到過這類問題，在液相色譜中，對于組分復雜的樣品，采用一種色譜體系，往往很難得到理想的分離效果，要么分離時間太長，要么分離度太差。這種情況，采用梯度洗脫就可以縮短分析時間，提高分離效果。下面和大家分享一則梯度微調(diào)實例，一起感受下梯度微調(diào)對分離效果的奇妙影響吧。

1、盡量在能長時間測試該項目的儀器上開發(fā)方法；

2、需要了解系統(tǒng)的性能，避免出現(xiàn)儀器系統(tǒng)改變后不能重現(xiàn)的問題；

3、要知道系統(tǒng)的兩個基本情況：梯度滯后體積和比例精確性。這可以在同一個實驗里得到這兩個數(shù)據(jù)：參考《JJG 705 2014液相色譜儀檢定規(guī)程》中《梯度誤差》實驗：在B溶液（0.1%丙酮）后加紫外檢測器，設(shè)置一個多階層的梯度，B溶液以5%的幅度從0%變到100%，流速與平常一樣，流速為1mL/min。每段梯度大概保持5min。然后接二通運行梯度，記錄圖譜。每段梯度設(shè)置的時間與實際發(fā)生的梯度時間之差就是梯度延遲時間，階層的高度可以用來測量流動相比例，這些階層可能有點模糊，是由系統(tǒng)中混合體積造成的；

4、檢測完系統(tǒng)，就可以按照它的性能來設(shè)計方法。梯度方法轉(zhuǎn)換大的問題是梯度滯后體積，如果知道儀器的滯后體積比初開發(fā)方法的儀器大，就要自覺的在方法前加一段等度來抵消這一差別，如果目標系統(tǒng)滯后體積小，就要在轉(zhuǎn)移方法的時候在方法開始加一段梯度延遲時間，如果比例差別是在梯度運行中間出現(xiàn)的，也可以通過調(diào)節(jié)梯度圖譜來抵消這種差別，但是一般很少遇到過需要這么做的情況。

5、初始流動相沒有充分平衡。柱子已經(jīng)用初始流動相平衡了，但在分析中，梯度變化很快，而柱子沒有用初始流動相充分平衡好，這樣di一針時總是與后面的不一樣。但是如果轉(zhuǎn)移到有不一樣滯后體積的系統(tǒng)時，可能就是另一種情況。

項目背景

名稱：12種酚類

色譜柱：月旭Ultimate ® AQ-C18 4.6mm*150mm,5μm

流動相A：水   流動相B：乙腈

問題：柱子正常活化進樣，基線和整體出峰均不理想，分離度較差。

1.柱子在運輸或儲存過程中保存液發(fā)生變化，導致填料產(chǎn)生微小改變，碳鏈蜷縮，未舒展開來，對目標物的保留造成影響；

2.儀器系統(tǒng)存在梯度滯后，在梯度變化過程中，兩相混合不精準，導致的物質(zhì)分離問題；

3.目標物受溶劑效應影響；

4.梯度變化過快，流動相的洗脫能力太強，導致色譜峰未達到分離效果。

1.測試梯度滯后體積和比例精確性；

2.用初始流動相0.2流速過夜平衡柱子；

3.樣品用初始流動相溶解（慎用，改變樣品溶劑后需要驗證樣品溶液的穩(wěn)定性）；

4.調(diào)節(jié)梯度，減緩洗脫速率，減小洗脫能力；

基線和峰形大有改善，但是后一個峰在梯度時間外出峰了。

梯度變化中，水相速率增長較快，物質(zhì)保留變強，沒有獲得足夠的洗脫能力，后一個物質(zhì)出峰較晚。

前段分離好的梯度不做調(diào)整，調(diào)整后一個物質(zhì)出峰梯度階段的有機相比例，增加洗脫能力。

以上說明，項目的成功與否，不僅取決于色譜柱類型，儀器條件，還有方法的建立。其中流動相便是考察重點，流動相梯度洗脫必要時可以充分應用上，他是由幾種不同極性的溶劑組成，通過改變流動相中不同時間段各溶劑組成的比例改變流動相極性，使每個流出的組分都有合適的容量因子，并使樣品的所有組分在短時間內(nèi)實現(xiàn)佳分離。好啦，今天的分享就先到這，希望能對小伙伴們有所啟發(fā)有所幫助哦。