凝膠柱的選擇與凝膠的預(yù)處理

在選擇凝膠柱時(shí)，從外觀、質(zhì)地結(jié)構(gòu)和性能來講，所選柱子要透明光滑，內(nèi)徑一致，耐壓防腐，柱子物料須生物兼容，并有良好的物理化學(xué)抗性和穩(wěn)定性。一般的柱材料多為玻璃或有機(jī)玻璃，在使用鋼柱時(shí)，特別要注意防腐蝕。另外，柱子終端要有采集器和過濾網(wǎng)，柱底板要求耐壓且不容易堵塞。死體積應(yīng)小于0.001Vt，如果死體積過大，被分離組分可能會(huì)重新混合，導(dǎo)致洗脫峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，降低分辨率。底板過濾介質(zhì)要求新，且?guī)в心芘c凝膠融合的網(wǎng)孔，避免接觸網(wǎng)孔和過濾介質(zhì)的表面，因?yàn)橹讣y會(huì)使樣品的分離程度下降。在裝柱或重新裝柱時(shí)，所有部位必須*清洗干凈。

凝膠柱的長(zhǎng)度和內(nèi)徑主要取決于加樣體積的多少和對(duì)分辨率的要求。凝膠柱的長(zhǎng)度對(duì)分辨率的影響較大，長(zhǎng)柱的分辨率要比短柱的高，但過長(zhǎng)會(huì)引起柱內(nèi)不均一、liu速過慢，柱長(zhǎng)度一般不超過100cm。同時(shí)，也要有適當(dāng)?shù)闹鶅?nèi)徑，內(nèi)徑過粗會(huì)產(chǎn)生蛋白樣品較為嚴(yán)重的橫向擴(kuò)散現(xiàn)象，內(nèi)徑過細(xì)，靠近柱內(nèi)壁的流速會(huì)大于中心的流速，產(chǎn)生“器壁效應(yīng)"，影響分離速度和效果。通常使用的凝膠柱長(zhǎng)度在25-70cm，內(nèi)徑在4-16mm，H/D（高徑比）一般在 （25:1）-（100:1）之間。用于組別分離的凝膠柱，其H/D 可相對(duì)低一些；進(jìn)行分級(jí)分離時(shí)H/D可在（30:1）-（100:1）；而脫鹽柱由于對(duì)分辨率的要求較低，一般用短柱，H/D大多在（5:1）-（25:1）之間。如果要分離的蛋白質(zhì)分子量相差較大，可選用H/D=（15:1）-（50:1）的柱子，且柱體積要大于4-15倍的樣品體積；如要分離的蛋白質(zhì)分子量差異較小，則選用H/D=（20:1）-（100:1）的細(xì)柱，且柱體積要大于25-100倍的樣品體積。在純化蛋白質(zhì)時(shí)，為了得到較好的分辨率，柱子的H/D 應(yīng)在（20:1）-（40:1）。

此外，選擇柱子時(shí)還應(yīng)考慮凝膠顆粒的大小。如填裝小顆粒凝膠，適合使用較大直徑的色譜柱；用粗顆粒填裝時(shí)，則用較小直徑的柱子。

市售凝膠一般呈干粉顆粒狀（如 Tandex） 或水懸浮狀 （如Tanrose CL）。一些不宜在脫水干燥狀態(tài)下保存的凝膠 （如瓊脂糖凝膠），應(yīng)存放在含防腐劑的水溶液中，這些凝膠在使用前不需要進(jìn)行溶脹處理。另外，多孔硅膠和多孔玻璃也不需要溶脹處理。為了盡量減少不同溶劑對(duì)柱床體積的影響，獲得理想的分離效果，應(yīng)將干膠緩慢倒入5-10倍干膠體積的洗脫液中充分溶脹。若溶脹不夠，則達(dá)不到有效的分離，而且在使用過程中會(huì)引起凝膠柱破裂。

根據(jù)蛋白質(zhì)樣品的分子量和分辨率要求選擇好所用凝膠的類型后，再根據(jù)柱體積和凝膠的吸水性質(zhì)估算出干膠的用量。由于凝膠在預(yù)處理和實(shí)驗(yàn)操作過程中有一定量的損失，所以在實(shí)際稱取時(shí)應(yīng)高于理論計(jì)算值的10%-20%。