帶你了解親和色譜法

親和色譜基于生物分子固有的特異性相互作用進行樣品的高選擇性分離。特異性相互作用包括醇能與底物、抑制物、輔酶等的結合；抗體與抗原的結合：凝集素與細胞表面抗原以及某些糖類的結合等。

分離原理如圖所示：

將可以與目標分離分子產生特異性相互作用的分子固定在固定相基質上，復雜樣品基質中的分子由于不存在這種特異性作用，因此與固定相的作用相對較弱，被率xian洗脫，目標分子最后被洗脫。

依親和色譜固定相所帶配基與樣品之間相互作用可將其分為專用型和通用型兩類。親和配基既可以與基質直接偶聯，也可以通過間隔臂間接連接。

適當的間隔臂可以有效地克服基質表面的位阻效應，使得配體更容易與被分離物結合，帶有間隔臂的AFC固定相往往具有更為優(yōu)異的色譜性能。對以小分子為配體分離大分子的親和固定相來說，間隔臂的作用顯得更為重要。AFC固定相的間隔臂按其結構類型,主要包括烴類、鏈狀的聚胺類、肽類、鏈狀聚醚類等。氨烷基化合物NH₂(CH₂)nR，R是常用的間隔臂，其中，R可為羧基、羥基、氨基或配位體自身。具有疏水性的間隔臂可能與配基或樣品間產生非特異相互作用,干擾親和分離。為消除非特異性吸附干擾,可在沿間隔臂分子的長軸方向某些原子上偶聯亞氨基、羥基等官能團，增加親水性。

親和色譜固定相上固定的配基包括染料配基、金屬離子配基、包合配合物配基、特異性民基、電荷轉移配基和共價配基。三嗪活性染料的結構與生物酶的天然底物接近,可與酶活蛋白質的活性位點結合應用于親和色譜。Cu²⁺、Zn²、Ni²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺等金屬離子通過具有整合作用的有機官能團固定在基質或間隔臂上,利用螯合物中的金屬離子與生物分子間的特異性親和作用實現生物分子的分離或純化。常用的螯合劑包括亞氨基二乙酸、亞氨基二乙醛、肟、硫脲、吡啶咪唑、8-羥基喹啉等。

包合物配基由主體與客體分子間特殊親和作用力形成,主體化合物具有環(huán)狀知或穴,客體分子可以被包合在環(huán)內或空穴內形成包合物。常用的主體分子包括環(huán)糊精、杯芳烴等。

為了保持生物分子的活性,一般需要采用溫和的洗脫條件。親和色譜中通常采用具有不同pH的緩沖溶液作為流動相，緩沖體系由無機或有機弱酸、弱堿與其鹽組成。為保持分子的活性：P值保持在6~8之間。滿足這一條件的沖體系較少，包括酸鹽、三基)氨基甲烷(Tris-HCI)、硼酸鹽等。磷酸鹽緩沖溶液緩沖容量較小，且容易與高價陽離子生成沉淀，并在很多代謝體系中起到抑制劑的作用。Tris-HCl體系在pH<7.5時緩沖容量小有較強反應活性,也同樣對很多代謝體系有抑制劑作用。硼酸鹽體系可與眾多生物有機物成配合物影響分離。甘氨酰甘氨酸在pH>8時緩沖能力ji強,但pH=7.5以下幾乎沒有緩符作用。

由Good等計研發(fā)的Goods系列沖溶液包括12種緩沖溶液，具有緩沖能力強、低子強度等特征，可在pH=6.1~10.7范圍內應用于生物學和生理學研究。

通用型親和配基與溶質之間作用力通常不強,大多數情況下非選擇性流動相即可完成不同組分的分離。當生物分子與配基形成穩(wěn)定常數較小的配合物時，等度條件下，采用洗脫能力弱的、具有不同pH值的緩沖溶液即可使配合物解離實現洗脫。當除了配位作用，還有靜電吸引力、氫鍵力或疏水相互作用等引起的非特異性相互作用存在時，可通過改變p出值離子強度、流動相極性、加入離液序列試劑等消除其干擾。其中離液序列試劑可改變生物分子結構，使蛋白質變性從而破壞親和作用。采用低濃度離液序列試劑能夠在盡可能保持蛋自質分子結構基礎上實現快速洗脫。

專用型親和配基與目標溶質間親和作用較強，需要采用含有特定組分、具有chao強洗能力的流動相進行洗脫。此時，通常在流動相中加入另一種游離配基以取代固定相上的配基與目標化合物結合實現洗脫。此外，還可以通過選擇性斷裂固定相基質與配基之間的化學鍵的方法實現洗脫。由于洗脫后目標分子仍與配基相連，需采用適當方法（如改變pH值或加入變性劑等）將其游離出來。

在親和色譜分析中，分離、純化的對象皆為氨基酸、多肽、蛋白質、核破、核苷、核苷酸、寡聚和多聚核苷酸、核糖核酸、脫氧核糖核酸以及酶、輔酶、寡糖、多糖等生物分子，其中大多數為極性化合物，不少還具有生物活性。因此，當從固定相上將它們洗脫下來時需使用H值接近于中性的稀緩沖溶液，以在比較溫和的洗脫條件下，保持其生物活性。親和色譜分離進行前，需先對固定相進行平衡，平衡緩沖溶液的pH、離子強度、溫度和化學組成都應使配基與溶質之間產生較強的相互作用以利于保留。溫度是親和色譜分離的重要條件，親和作用強度通常隨溫度升高而減小，可利用不同的溫度吸附和脫附。配基與生物分子間相互作用達到平衡的過程緩慢,樣品應以較慢速度加載,流動相流速也不應過快。對親和力較強的固定相，樣品體積的影響不大；親和力較弱時，樣品體積不宜過大。梯度洗脫時，可采用溫度梯度、pH梯度或離子強度梯度。